有研究表明，在结直肠癌中，肿瘤核心和侵袭性边缘的T-Cell 的密度与肿瘤患者的生存期呈现明显的正相关性。后期的相关研究也表明了“免疫环境”对患者生存的预测价值。利用HALO^TM分析IHC标记或IF标记的免疫细胞标记，Tumeh等研究学者发现肿瘤侵袭性边缘的CD8+细胞密度能够有效预测抗-PD1 药物的治疗效果。这些研究高度阐明了免疫细胞空间分布的重要性，能够帮助我们理解免疫系统、肿瘤之间的复杂的复杂关系，并最终对我们预测病人的生存期以及选择合适的治疗方式有极大的作用。

本文描述了利用HALO 分析工具，用于在肿瘤微环境中定量免疫细胞相对肿瘤细胞的分布，邻近分析以及肿瘤浸润性分析。

Proximity Analysis用于定量两个细胞或对象群体间的空间关系。在免疫肿瘤学中，主要应用Proximity Analysis的应用有1）计算免疫标记的细胞（如CD8, CD3, CD4）在肿瘤细胞一定距离的细胞数，2）检测两个细胞群体间的距离。可以利用双重IHC，多重IHC，多重IF在单个切片和一系列平行的切片上分别对免疫细胞、肿瘤细胞进行染色。

图1 为一系列胰腺肿瘤切片上进行Proximity Analysis 的一个案例。利用图像配准工具对Pan-CK标记肿瘤的切片和CD3 标记T-cell 的切片进行配准。其中Pan-CK染色的切片利用Membrane IHC module 进行分析，CD3染色的切片利用Cytonuclear IHC module 进行分析。

图1 CD3+细胞与Pan-CK+细胞在一系列配准图像上的Proximity Analysis。A、B Pan-CK+染色的代表性区域；C、D CD3染色的代表性区域。（阳性细胞被标记为黄色）；E Pan-CK+肿瘤细胞与CD3+细胞的空间。

随后利用Spatial Analysis 工具绘制Pan-CK细胞与CD3细胞的空间分布图（图1E）。一旦细胞数据被绘制出来，Proximity Analysis能够定量整个图片CD3+的数量，CD3+细胞距离肿瘤细胞一定距离内的数量（50 μ m），百分比，CD3+细胞与肿瘤细胞的平均距离，并根据细胞数量自动绘制相应的柱状图（图2）。这个案例中，在距肿瘤细胞4.5~5μ m处观察到CD3+ 细胞的峰值。

图2 CD3+ 免疫细胞邻近肿瘤细胞的直方图

有研究表明，包括具有里程碑意义的“免疫评分”的研究，均发现在肿瘤浸润边缘（IM）免疫细胞的密度与生存期、治疗效果有显著的相关性。Tumor Infiltration Analysis 工具可以有效的简化肿瘤浸润的分析。不像Proximity Analysis，此工具不需要进行肿瘤细胞的分析，因此，不需要肿瘤特异性的标记、一系列的配准切片，双重或多重染色。

图3 中，肺癌的CD8染色切片显示肿瘤浸润性的边缘分析。与Proximity Analysis一起，首先利用Cytonuclear IHC对图像进行分析，以确定切片中每一个CD8+细胞在切片中的坐标位置。随后用注释工具在图像中手工绘制肿瘤的边界（图3）。注释两边的浸润性边缘被高亮为“彩虹”标记。

图3 CD8+在浸润性肿瘤边缘的细胞密度。A Cytonuclear IHC分析CD8+细胞，浸润性的肿瘤边界利用HALO的注释工具进行手工绘制。B CD8+细胞距离肿瘤边界的密度直方图。

这个案例中，为了生成细胞密度直方图，根据肿瘤便捷的距离，对侵入肿瘤边缘的CD8+细胞进行计数及汇总。

本案例中，我们观察到CD8+细胞的密度在侵入性边缘的内部及外部的0~100pm内最高。当向肿瘤核心移动是，CD8+细胞密度的减少明显降低。而肿瘤外的CD8+ 细胞的密度增多。

REFERENCES

Galon, J, et al. Science. 2006; 313: 1960-4.

Fridman, W.H., et al. Nat Rev Cancer. 2012; 12:298-306 Tumeh, P.C., et al. Nature. 2014; 515:568-71

Corresponding Author: Kate Lillard Tunstall, CSO, Indica Labs, +44 (0)1789 765 721,